dld-diagnostika 組胺 ELISA使用說明書

組胺 ELISA

酶免疫分析

用于定量測定血漿、尿液和細胞培養基中的組胺

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dld-diagnostika 組胺 ELISA目錄

1. 試驗介紹和原理

組胺（β-咪唑-乙胺）是一種生物胺，是組氨酸代謝的產物。由組氨酸脫羧產生。

組胺廣泛分布于哺乳動物組織中。它與肝素（非活性形式）結合并儲存在嗜堿性白細胞和肥大細胞的顆粒中，并根據需要主動釋放。這些細胞如果被附著在其膜上的 IgE 抗體致敏，當暴露于適當的抗原時發生脫顆粒。

組胺在過敏反應的初始階段起主要作用。

變應原給藥后血漿中組胺的定量具有臨床意義。

組胺是對外來病原體免疫反應的一部分，它增加毛細血管對白細胞和  其他蛋白質，以便允許它們在受影響的組織中與外來入侵者接觸。負責組織中組胺生物學效應的是不同表面受體的激活，例如 H1、H2 和 H3。

組胺參與調節腸道生理功能，并作為神經遞質發揮作用。

競爭性組胺 ELISA 試劑盒使用微量滴定板形式。組胺與微量滴定板的固相結合。?；M胺和固相結合組胺競爭固定數量的抗血清結合位點。當系統處于平衡狀態時，通過洗滌除去游離抗原和游離抗原-抗血清復合物。通過抗兔/過氧化物酶檢測與固相組胺結合的抗體。在 450 nm 處監測底物 TMB/過氧化物酶反應。與固相組胺結合的抗體量與樣本中的組胺濃度成反比。

2. 注意事項

· 僅供體外診斷使用。

· 應使用一次性手套和護目鏡。

• 對本試劑盒中使用的所有人源試劑進行了 HIV I/II 抗體、HCV 和 HBsAg 檢測，結果均為陰性。但是，由于沒有任何試驗方法可以*保證不存在傳染性病原體，因此這些試劑應作為具有潛在生物危害性的材料進行處理。
• 試劑盒制備中使用的動物源性材料來自經認證的健康動物，但這些材料應視為具有潛在傳染性進行處理。

· 該試劑盒的某些組分含有有害試劑。這些組件標有適當的危險標簽。

3. 儲存和穩定性

到貨后，在 2-8 °C 條件下儲存試劑盒。一旦開封，試劑盒在失效日期前可保持穩定。有關制備試劑的穩定性，請參閱試劑制備。請勿使用超過試劑盒標簽所示失效日期的組分。請勿在單次測定中混合任何試劑盒組分的不同批次。

4.3 對照 1 和 2

每 4 mL，即用型范圍：見 q.c. 證書

2 瓶

4.4 酰化緩沖液

6 mL，顏色代碼為藍色，即用型

4.5 酰化試劑凍干，將內容物溶于 1.5 mL 溶劑

1 瓶

3 瓶

4.6 溶劑

5.5 mL 溶劑溶解?；噭┖?，即用型

    警告              危險

4.7 抗血清

5.5 mL，即用型，顏色編碼為黃色兔抗 N-酰基-組胺

1 瓶

1 瓶

4.8 酶結合物

12 mL，即用型

羊抗兔 IgG 過氧化物酶

       警告

1 瓶

4.9 清洗緩沖液

20 mL，50 倍濃縮

用蒸餾水將內容物稀釋至 1 l 總體積

4.10 底物

12 mL TMB 溶液，即用型

4.11 終止液

12 mL，即用型

含 0.3 M 硫酸

4.12 反應板

用于酰化

4.13 平衡試劑

凍干，用蒸餾水溶解內容物，體積：見小瓶標簽

1 瓶

1 瓶

1 瓶

2 個平板

1 瓶

需要但未提供的其他材料和設備：

· 20、30、50 和 100µl 移液器

· 回旋振蕩器

· 多通道移液器或微孔板清洗裝置

· 微孔板光度計 (450 nm)

· 蒸餾水

5. 標本采集和儲存

可使用 EDTA 或肝素血漿、尿液和細胞培養基進行檢測。

應避免樣本反復凍融。

血漿

可使用 EDTA 或肝素血漿。不應使用溶血和脂血樣本。

樣品可在 2-8 °C 下儲存長達 6 小時。對于更長時間的儲存（長達 6 個月），樣品必須在-20 °C 下冷凍。

尿液

本試驗以及收集的尿液均可采用自發性尿液。在這種情況下，應收集 24 小時內排泄的尿液總量，并在含有 10-15 mL 6M 鹽酸（作為防腐劑）的單個瓶中混合。避免暴露于陽光直射。測定總體積并取等份試樣進行測量。對于疑似腎臟疾病的患者，也應檢測肌酐濃度。尿樣可在-20 ℃ 保存至少 6 個月。

尿樣必須用蒸餾水以 1:15 稀釋。測定前用水。

細胞培養基

試驗中可使用 DMEM 和 RPMI 等培養基。用戶必須檢查其他媒體。

6. 試劑和樣品制備

6.1. 試劑制備

清洗緩沖液

用蒸餾水稀釋內容物。水的總體積為 1,000 mL。

稀釋的清洗緩沖液必須在 2-8 ℃ 下儲存長 4 周。在-20 ℃ 下冷凍儲存更長時間。

平衡試劑

用蒸餾水溶解內容物。水（體積參見小瓶標簽），短暫混合，置于滾筒混合器上至少 20 min。小心處理，以盡量減少泡沫形成。復溶后的平衡試劑應在-20 ℃ 下冷凍儲存，并在小瓶標簽上打印的失效日期前保持穩定。

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將一瓶內容物溶于 1.5 mL

并振搖 5 次

在定軌振蕩器上運行分鐘。?；噭┍仨氃谂R用前制備。使用后，必須丟棄試劑。

第 2 個和第 3 個小瓶分別允許進行第 2 次和第 3 次運行檢測。如果要在一次運行中使用整個試劑盒，建議合并三瓶酰化試劑的溶解內容物。

請注意，溶劑與許多塑料材料（包括塑料托盤）發生反應；溶劑不與正常移液器吸頭和玻璃裝置發生反應

溶劑易揮發，溶解的酰化試劑迅速蒸發。因此，請做不一起使用具有大表面的托盤  用多通道移液器移取?；噭Ｏ喾矗褂?Eppendorf multipette（或類似器械），用溶解的?；噭┲苯訌男∑抗嘌b注射器并逐孔加入。

所有其他試劑均為即用型。

6.2. 樣品制備（酰化）

使試劑和樣本達到室溫。建議重復測定。

酰化反應板的孔只能使用一次。因此，使用前請標記各孔。

1. 各移取 50µl 標準品 1-6、50µl 對照品 1 和 2，

50µl EDTA 血漿樣本，20 µl肝素血漿，50µl 尿液樣本（用蒸餾水以 1:15 稀釋。水）和 50µl 細胞培養基樣品至反應板的相應孔中。

2. 移取各 50µl ?；彌_液至所有孔中。

3. 移取 50µl 蒸餾水。所有含有血漿樣本的孔中均有水。

• 分別移取 50µl 平衡試劑至含有標準品、對照品、尿樣和細胞培養基的孔中  樣品。分別移取 30µl 平衡試劑至含有肝素血漿的孔中。請勿移取至含有 EDTA 血漿樣本的孔中?；旌戏磻?10 秒。
• 分別移取 10µl 酰化試劑至所有孔中并繼續  步驟 6。立即。顏色變為紫色。

請注意，溶劑與許多塑料材料（包括塑料托盤）發生反應；溶劑不與正常移液器吸頭和玻璃裝置發生反應

溶劑易揮發，溶解的酰化試劑迅速蒸發。因此，請做不使用具有大表面的托盤和多通道移液器移取酰化試劑。相反，使用 Eppendorf multipette（或類似器械），用溶解的酰化試劑直接從小瓶灌裝注射器，并逐孔灌裝。

• 室溫下在定軌振蕩器上以中頻孵育 15 min。做不蓋住孔或板；在振蕩器上保持板打開。

7. 移取 50µl 抗血清至所有孔中。

• 室溫下在定軌振蕩器上以中頻孵育 30 min。做不蓋住孔或板；在振蕩器上保持板打開。

每取 50µl 用于 ELISA。

7. 檢測方法 (ELISA)

使試劑和樣本達到室溫。建議重復測定。

1. 分別移取 50µl 制備的標準品 1 至 6、對照品和樣品，置于包被微量滴定條的相應孔中。

2. 室溫 (20-25 ℃) 下在定軌振蕩器上以中頻孵育 60 min。

備選方案：手動短暫振搖微孔板，孵育 90 min，不得振搖。

• 棄去或吸出孔內容物，分別加入 300µl 清洗緩沖液，再次棄去或吸出孔內容物。通過輕敲干凈吸水紙上的倒置板去除殘留液體。

重復洗滌程序 4 次。

4. 分別移取 100µl 酶結合物至所有孔中。

5. 室溫下在定軌振蕩器上以中頻孵育 20 min。

備選方案：手動短暫振搖微孔板，孵育 25 min，不振搖

6. 清洗：重復步驟 3。

7. 吸取各 100µl 底物至所有孔中。

8. 室溫 (20-25 °C) 下在定軌振蕩器上以中頻孵育 20±5 min。

備選方案：手動短暫振搖微孔板，孵育 20±5 min，不振搖

9. 移取各 100µl 終止液至所有孔中。

• 在 15 min 內，在微孔板光度計中讀取 450 nm（參考波長在 570-650 nm 之間）處的光密度。

8. 結果計算

在半對數曲線圖上，標準品的濃度

（x 軸，對數）對其相應的光密度（y 軸，線性）作圖?；蛘?，各標準品和樣品的光密度可與零標準品的光密度相關，以 OD/OD 比值表示大值然后繪制在 y 軸上。建議采用 4 參數迭代或三次樣條進行評價。

對照品、血漿樣品和細胞培養基的濃度可以使用其平均光密度直接從該標準曲線讀取。

肝素血漿樣本的讀取濃度必須乘以因子 2.5。

尿液樣本的讀取濃度必須乘以因子 15。

轉換：1 ng/mL 相當于 9.0 nmol/L

典型標準曲線：

9. 試驗特征

9.1 正常值范圍

以下給出的參考范圍應僅作為指導原則。建議各實驗室建立自己的正常值。

9.2 靈敏度

取零參比品吸光度的 2 倍標準偏差，從標準曲線讀取相應值，確定檢測下限。

9.3. 特異性（交叉反應性）

檢測結構相關組分對 ELISA 方法中使用的抗組胺抗血清的可能干擾。

9.4. 恢復

向各樣品中加入遞增量的組胺。分析各加標樣品。采用理論預期值和實際測定值，估算不同濃度下組胺的分析回收率。

濃度 (ng/ml)

9.5. 線性

使用樣品的不同稀釋液研究 ELISA 方法的線性。

濃度 (ng/ml)

9.6. 重現性

通過測定批內和批間變異系數 (cv)，研究 ELISA 方法的重現性。

濃度 (ng/ml)

10. 文獻

• Nettis,E.;Colanardi,A.;Ferrannini,A. (2005) :

抗組胺藥作為調節炎癥的重要工具

曲線中位數化學-抗炎藥和抗過敏藥, 4, 81-89

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吡喹酮治療日本血吸蟲感染后肥大細胞依賴性組胺釋放：對化療相關不良反應的影響寄生蟲研究 88:888–893

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組胺和甲基組胺動力學的相互依賴性：建模和模擬方法

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人尿中 1-甲基組胺和 1-甲基咪唑乙酸測定作為肥大細胞增多癥診斷工具

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精神分裂癥患者尿液排泄與腦脊液中生物胺及其代謝產物的關系

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蜂毒過敏患者在脫敏治療成功或失敗后因刺痛激發導致的類胰蛋白酶和組胺釋放

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獼猴支氣管灌洗的含組胺細胞。過敏性組胺釋放的時間進程和抑制

Archs Allergy appl.免疫。62:205-212

移液方案樣品制備

振搖 10 秒

立即室溫下振搖 15 min，保持平板打開

室溫下振搖 30 min，留板，每取 50µl 用于 ELISA

ELISA 移液方案

室溫下振搖 60 min4 次清洗

室溫下振搖 20 min4 次清洗

室溫下振搖 15-25 min

450 nm 處吸光度讀數