molzym S-040-0100說(shuō)明書(shū)

質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

使用無(wú)DNA水代替模板DNA的陰性PCR對(duì)照用于分析純化終預(yù)混液中細(xì)菌DNA的污染。保證使用擴(kuò)增大小 > 200 bp的通用16S rDNA引物進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)40個(gè)PCR循環(huán)，陰性對(duì)照中無(wú)信號(hào)的比率≥97%（前提是避免處理錯(cuò)誤導(dǎo)致的污染）。無(wú)DNA的預(yù)混液定義為不產(chǎn)生細(xì)菌DNA特異性信號(hào)。在陰性對(duì)照運(yùn)行中，必須證明凝膠電泳分析中不存在條帶。使用從金黃色葡萄球菌或其他細(xì)菌中提取和純化的已知量基因組DNA運(yùn)行陽(yáng)性對(duì)照。或者，使用Molzym的DNA陽(yáng)性對(duì)照（目錄號(hào)：否。S-200-050）。

PCR方案

注意所有操作均在無(wú)DNA的環(huán)境（UV輻照工作站）中進(jìn)行。確保塑料耗材（包括PCR小瓶、移液器吸頭、螺旋蓋聚丙烯管）與擴(kuò)增反應(yīng)混合物結(jié)合使用時(shí)無(wú)污染細(xì)菌DNA。按照以下步驟順序工作：

1. 在室溫(18-25 ℃)下解凍預(yù)混液。渦旋幾秒鐘以混勻并短暫離心小瓶。4 ℃保存?zhèn)溆谩olTaq 16S放入另一個(gè)冷卻架（-15至-25）

℃）。使用后，將組分儲(chǔ)存在-15至-25 ℃下。

2. 移取xµl提供的無(wú)DNA水（體積為25µl）至每個(gè)PCR小瓶中。保持小瓶冷卻。
3. 加入10µl 2.5x預(yù)混液
4. 加入0.5µl正向引物(10µM)
5. 加入0.5µl反向引物(10µM)
6. 加入0.8µl MolTaq 16S
7. 后加入yµl模板。密封小瓶并保持冷卻，直至置于PCR儀中
8. 啟動(dòng)特定試驗(yàn)的程序

對(duì)于例如10個(gè)反應(yīng)，使用以下移液方案（加入2µl模板DNA）在無(wú)DNA螺旋蓋或聚丙烯瓶中制備1x預(yù)混液：

• 120µl無(wú)DNA水
• 100µl 2.5x預(yù)混液
• 5µl正向引物(10µM)
• 5µl反向引物(10µM)
• 共8µl MolTaq 16S 238µl

從該1x預(yù)混液中移取23µl至每個(gè)PCR小瓶中，并加入2µl模板DNA或2µl提供的無(wú)DNA水（陰性PCR對(duì)照）。使用每個(gè)PCR系列，運(yùn)行由從細(xì)菌培養(yǎng)物中提取的DNA標(biāo)準(zhǔn)品（10-100 ng/反應(yīng)）組成的陽(yáng)性對(duì)照。

PCR熱循環(huán)條件：

使用檢測(cè)試劑的特定條件。1x預(yù)混液多可使用40個(gè)循環(huán)。

使用標(biāo)準(zhǔn)凝膠電泳技術(shù)或雜交探測(cè)分析PCR反應(yīng)。